CROMATOGRAFIA LÍQUIDA DE ALTA EFICIÊNCIA (HPLC)

A cromatografia líquida de alta eficiência (CLEA), ou a sigla mais conhecida, vinda do inglês HPLC (High Performance Liquid Cromatography), segue o mesmo princípio básico da cromatografia, os componentes diferentes na amostra têm variações de afinidades com o material adsorvente e essa é uma técnica de cromatografia planar. Ela é útil para separação de materiais com grande peso molecular, que possuem volatilidade muito baixa e não podem ser separados por cromatografia gasosa, outra vantagem dessa técnica de cromatografia é a sua velocidade e sensibilidade mais elevada do que quando comparada com a cromatografia líquida.

A HPLC utiliza uma fase móvel líquida para separar os componentes da amostra. Os componentes são dissolvidos em um solvente e, em seguida, forçados a passar por uma coluna de alta pressão. Os componentes então interagem com a fase estacionária e saem em diferentes momentos, da mesma forma que a cromatografia gasosa.

Ao invés de introduzir o solvente na coluna e deixar que ele goteje para baixo pela influência da gravidade, a HPLC faz com que a amostra seja forçada, através da coluna sob altas pressões de quase 400 atm, ocasionando assim uma separação mais rápida e eficiente.

Equipamento de cromatografia líquida de alta eficiência.
FONTE: Thermo Quantum Ultra QqQ MS with HPLC (UV and Fluorescence). Disponível em: https://cmm.centre.uq.edu.au/thermo-quantum-ultra-qqq-ms-hplc-uv-and-fluorescence

O equipamento para a realização desse tipo de cromatografia é denominado de cromatógrafo líquido que é constituído por vários sistemas, sendo eles:

Sistema de reservatório da fase móvel: a fase móvel é colocada em um reservatório de vidro e é geralmente uma mistura dos líquidos polares e não-polares cuja concentrações dependem da composição da amostra.
Sistema de bombeamento de fase móvel: o solvente na fase móvel é bombeado até o reservatório, através da coluna de HPLC.
Sistema de injeção: a amostra é injetada na coluna por um injetor que que é capaz de operar com volumes de amostra na escala de 0,1 – 100 mL em altas pressões.
Sistema analítico que é constituído pela coluna cromatográfica: as colunas de HPLC são normalmente feitas de aço inoxidável e são de 50 – 300 mm com um diâmetro interno de 2 – 5 mm, com uma fase estacionária com um tamanho de partícula de 3 – 10 µm. A coluna cromatográfica é feita de um material inerte que resista a todas as pressões que ela pode ser utilizada, as colunas geralmente utilizadas são octadecil (C18, PR18, ODS), octil (C8, RP8), CN (cianopropil) e NH₂ (amina).
Sistema de detecção: existem vários sistemas, os mais utilizados na HPLC são os fotométricos, baseados na absorbância no ultravioleta e no visível, devido a sua sensibilidade a substâncias que fluorescem, e a sua capacidade de detectar quantidades de ordem de picograma.
Sistema de aquisição e registro de dados: o sinal do detector é recebido e registrado por um computador que processa, armazena, e reproduz dados.

Esquema de funcionamento de uma cromatografia líquida de alta eficiência.
FONTE: O que é a Cromatografia Líquida de Alta Eficiência?. Disponível em: < https://freitag.com.br/blog/o-que-e-a-cromatografia-liquida-de-alta-eficiencia/>

A HPLC é normalmente empregada em amostras de alimentos, água, solo, sangue, urina, etc. ela é utilizada para fazer análises qualitativas como separação de um produto químico termicamente instável e de compostos biológicos, como drogas (ibuprofeno), sais (cloreto de sódio), proteínas (clara de ovos), produtos químicos orgânicos (poliestirenos), entre outros.

Ela também realiza análise quantitativa, determinando a contração de um composto. Realiza a preparação de substâncias puras para estudos clínicos e da toxicologia e na síntese orgânica. E a análise de traço, onde ela detecta concentrações muito baixas de uma amostra, muito utilizado o meio farmacêutico, na toxicologia, estudos biológicos entre outros.